外泌體是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡，是細(xì)胞間信號(hào)傳輸?shù)妮d體。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細(xì)胞間通訊。近年來(lái)，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升，在2019年國(guó)家自然科學(xué)基金獲批項(xiàng)目中，外泌體研究相關(guān)項(xiàng)目的總數(shù)突破500個(gè)，立項(xiàng)的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學(xué)顯微鏡無(wú)法對(duì)其進(jìn)行成像分析，因此很少有技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)外泌體進(jìn)行物理表征和蛋白分型。

美國(guó)NanoView Biosciences公司推出了全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView，系統(tǒng)采用了創(chuàng)新的SP-IRIS成像技術(shù)，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計(jì)數(shù)、粒徑、蛋白表達(dá)、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，目前在全球已近100多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻(xiàn)超過(guò)170篇。進(jìn)入2022年，使用ExoView發(fā)表的論文出現(xiàn)井噴性增長(zhǎng)，短短數(shù)月已經(jīng)發(fā)表了超過(guò)75篇。本文選取了兩篇在高水平期刊《Nano Letters》發(fā)表的比較有代表性的文章，來(lái)說(shuō)明ExoView在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、單外泌體亞群分析等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。

三維培養(yǎng)的MSC外泌體-水凝膠混合微針陣列貼片用于脊髓修復(fù)

脊髓損傷（SCI）是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是人類健康最嚴(yán)重的威脅之一。早先研究已證明間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)源的外泌體在SCI治療中方面具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，傳統(tǒng)的二維（2D）培養(yǎng)模式會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性喪失，從而影響間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（2D-Exo）的治療性能。三維培養(yǎng)模式產(chǎn)生的外泌體（3D-Exo）具有更高的治療效率，因此其在脊髓治療中也有著更為廣泛的應(yīng)用，但之前的相關(guān)報(bào)道極少。另外，傳統(tǒng)的外泌體治療通常依賴于局部的反復(fù)注射，遺憾的是這種方法由于清除速率很快導(dǎo)致治療效率低下，并且也可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)脊髓的二次損傷。因此，開發(fā)一種更加可靠、方便和有效的外泌體遞送方法，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的原位外泌體釋放成為新的研究方向。近日，韓敏等^[1]開發(fā)了一種可控的3D外泌體水凝膠混合微針陣列貼片以實(shí)現(xiàn)SCI原位修復(fù)。

其中，研究人員使用甲基丙烯?；髂z（GelMA）混合3D培養(yǎng)的MSC來(lái)源的外泌體構(gòu)建了用于微針陣列貼片，并用ExoView對(duì)2D-Exo和3D-Exo進(jìn)行了檢測(cè)。2D-Exo和3D-Exo的亞群計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，具有CD81+或（和）CD9+跨膜蛋白的外泌體數(shù)量最多（圖1 A和B）。2D-Exo和3D-Exo的熒光強(qiáng)度分布如圖1 C和D所示。熒光共定位分析結(jié)果顯示3D-Exo富含同時(shí)表達(dá)CD81+CD9+的外泌體（圖1 E、F、G、H）。此外，MSC-Exo粒徑的統(tǒng)計(jì)分析表明，2D-Exo的CD9+外泌體的平均粒徑為67±22nm，2D-Exo的CD81+外泌體的平均粒徑為70±25nm（圖1 I和J），3D-Exo的CD9+外泌體的平均粒徑為60±15nm，3D-Exo的CD81+外泌體的平均粒徑為59±14 nm（圖1 K和L）。總體而言，3D-Exo粒徑更小，更容易被靶細(xì)胞吞噬。熒光成像結(jié)果顯示，3D-Exo中CD81和CD9的熒光強(qiáng)度顯著高于2D-Exo（圖1 M和N )。

圖1     ExoView檢測(cè)2D-Exo和3D-Exo的亞群數(shù)量、熒光強(qiáng)度、共定位、粒徑分布以及進(jìn)行熒光成像

超靈敏的高通量液滴數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)單外泌體

由于外泌體在診斷和治療領(lǐng)域具有巨大潛力，因此單外泌體水平檢測(cè)一直是研究熱點(diǎn)。目前大多數(shù)的外泌體分析技術(shù)主要基于成像，但是較多成像技術(shù)檢測(cè)的粒子數(shù)量級(jí)有限，很難實(shí)現(xiàn)臨床樣本的高通量檢測(cè)（大于108 EV/ml）。此外，單一平臺(tái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度達(dá)到單外泌體水平、區(qū)分外泌體的不同亞群特異性以及高通量分析非常具有挑戰(zhàn)性。近期Zijian Yang等^[2]發(fā)明了一種高通量數(shù)字測(cè)定法，這是一種基于液滴可以對(duì)特定的單外泌體亞群進(jìn)行高通量量化分析的光流控平臺(tái)（DEVA）。

其中，研究人員使用ExoView對(duì)來(lái)源于人類神經(jīng)元的外泌體進(jìn)行分析，對(duì)開發(fā)的DEVA系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。ExoView可以通過(guò)免疫捕獲和熒光標(biāo)記對(duì)外泌體進(jìn)行分析，紅色熒光抗體代表CD63，綠色熒光抗體代表CD81，藍(lán)色熒光抗體代表CD9（圖2 A和B）。亞群計(jì)數(shù)結(jié)果顯示CD81+外泌體數(shù)量顯著高于CD63+或CD9+外泌體（p<0.05，p<0.0001），也顯著高于MIgG陰性對(duì)照（p<0.0001)（圖2 C）。CD81+外泌體的熒光共定位分析顯示每個(gè)標(biāo)記組代表一個(gè)不同的外泌體亞群，互相沒(méi)有交集，其中只標(biāo)記CD81熒光抗體的外泌體數(shù)量最多，其次是只標(biāo)記CD63熒光抗體和同時(shí)標(biāo)記CD63CD81熒光抗體的外泌體（圖2 D）。另外，在CD81+外泌體中，67% (64.3%-69.8%) 的外泌體同時(shí)共表達(dá)了另一個(gè)CD81蛋白（熒光標(biāo)記）（圖2 E）。因此，研究人員選擇使用CD81進(jìn)行捕獲和標(biāo)記，而不是使用神經(jīng)元特定的表面蛋白標(biāo)記物，這樣能夠量化和校準(zhǔn)DEVA的性能。

圖2 ExoView的原理示意圖以及ExoView檢測(cè)人類神經(jīng)元的外泌體的亞群數(shù)量、共定位和進(jìn)行熒光成像

在上述兩篇文章中，科學(xué)家借助美國(guó)NanoView Biosciences公司研發(fā)的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測(cè)樣本中的外泌體，無(wú)需純化，操作簡(jiǎn)單。一次結(jié)果直接輸出外泌體粒徑，絕對(duì)數(shù)目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。兩篇文章分別從間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、單外泌體亞群分析等研究領(lǐng)域介紹了ExoView的無(wú)需純化，全面表征的特點(diǎn)，有力地證明ExoView是外泌體檢測(cè)的一大利器。

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? 中國(guó)科學(xué)院深圳技術(shù)研究院在《Lab on a Chip》發(fā)表文章。

?  北京天壇醫(yī)院、國(guó)家納米科學(xué)中心、北京航空航天大學(xué)在《Advanced Science》發(fā)表文章。

?  同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)在《Journal of Nanobiotechnology》發(fā)表文章。

? 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS》發(fā)表文章

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參考文獻(xiàn)：

[1]  Min   Han ……& Tao Xin. (2022) Three-Dimensional-Cultured MSC-Derived Exosome-Hydrogel   Hybrid Microneedle Array Patch for Spinal Cord Repair. Nano Letters, 22, 15: 6391–6401.

[2]  Zijian   Yang ……& David A. Issadore. (2022) Ultrasensitive Single Extracellular Vesicle   Detection Using High Throughput Droplet Digital Enzyme-Linked Immunosorbent   Assay. Nano Letters, 22, 11: 4315–4324.

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1、全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)

2、ExoView外泌體全面表征試劑盒